引物（primers)设计知识介绍

一、引物（primers）

引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。

二、引物的重要性

在整个PCR体系中， 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。

三、引物设计原则

1. 引物长度

引物长度一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。

2. 碱基分布的均衡性

同一碱基连续出现不应超过5个

GC含量一般40-60%

GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性

GC含量太高也易于引发非特异扩增。

3. 引物Tm值

一般要求：55℃-65℃。

计算：

对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4（G+C）+2（A+T）来粗略估算

对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。

Tm = △H/（△ S + R * ln （C/4）） + 16.6 log （[K+]/（1 + 0.7 [K+]）） - 273.15

4. 引物二级结构

引物二聚体

尽可能避免两个引物分子之间3‘端有有较多碱基互补

发夹结构

尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。

5. 引物3‘端

引物的延伸从3’端开始，因此3‘端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3’端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。