ImageJ实用技巧

最近有很多同学都提到一个相同的问题：对于免疫荧光双标记的细胞，怎样能对双标的细胞进行计数？

这一问题在之前的一篇综述中没有提到：

Treasure琛：ImageJ实用技巧——细胞计数综述

注意：这里说的双标不是像下面这类，显而易见，直接能用一般方法进行计数，如果是这类情况，直接参考上面的综述。

这篇文章就介绍一下，怎么利用ImageJ对双标的细胞进行自动计数，这种方法同样可以作为一种简单的共定位分析。

这里以下图的脑片染色为例：

对于双标特别明细的细胞，我们可以直接利用Color Threshold进行双标细胞进行分割，在这个例子中，即通过Color Threshold圈选出黄色的细胞。例如下图：白色部分即为框选部分。

因为背景干扰较大，且部分红色、绿色通道的细胞亮度差异较大，不能用Color Threshold很好地框选出双标细胞。

所以需要采用另一种统计逻辑：

通过分别统计两个通道的细胞，得到两个通道细胞的ROI（Region of Interest），然后计算两个通道ROI的重叠部分（Overlap），再进行细胞计数。

一、利用机器学习的方法分割细胞

首先分别提取两个通道，参考这篇文章：

Treasure琛：ImageJ实用技巧——荧光&明场图片合并和分割(基本功能篇)

利用基于机器学习的细胞分割-Trainable Weka Segmentation，进行细胞分割，参考这篇文章：

Treasure琛：ImageJ实用技巧——基于机器学习的自动细胞分割(插件篇)

Create Result后，得到分割结果：

二、得到重叠部分的ROI

利用Threshold框选分割结果，然后创建选取区（Edit -> Selection -> Create Selection）

将选取区添加到ROI Manager当中，分别重命名为Red和Green：

关于ROI Manager的使用，参考：

Treasure琛：ImageJ实用技巧——径向荧光平均值检测(定量分析篇)

然后选中两个ROI，在More里面选择AND操作，即可得到重叠部分：

将重叠部分Add到ROI Manager中，重命名为Double Label：

三、对重叠部分进行自动细胞计数

放大之后，可见重叠部分有很多假阳性的杂点：

得到二值化图片（Edit -> Selection -> Create Mask）

之后的操作和自动细胞计数的流程一样，参考这篇文章：

Treasure琛：ImageJ实用技巧——自动细胞计数(解放双手篇)

先框选一个细胞，Measure得到细胞大小，例如在这里一个细胞的Area大概为207左右：

将细胞尺寸的下限定为150，以去除假阳性的杂点：

Analyze Particles之后，即可得到双标细胞总数为41个：

注意：单通道细胞分割的准确性，直接影响双标细胞的计数结果。建议单通道细胞分割要尽量准确，尽量减少假阳性。

如果对于ImageJ使用有什么问题可以私信我，或者给我发邮件：zhaoyc9@163.com